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前言
凡纳滨对虾是世界上、我国养殖产量最高的虾类。可以满足人们对优质蛋白质食品的需求。
此外，凡纳滨对虾还具有适应性强、易栽培、味道鲜美、出肉率高等特点，深受养殖户和消费者的喜爱。
但在养殖过程中，水温异常可能会导致生长抑制或死亡。适宜的气候对于南美白对虾养殖的成功尤为重要。
恶劣的天气条件会破坏养殖水环境的稳定性，诱发疾病暴发，最终影响凡纳滨对虾的成活率和产量。
凡纳滨对虾对低温环境非常敏感。持续的低温会降低虾的食欲和消化酶的活性，从而导致消化系统和免疫系统功能减弱，对凡纳滨对虾的养殖造成严重威胁。
持续高温还会扰乱凡纳滨对虾渗透压的生理调节，加速养殖池内残留饵料和粪便的发酵，导致养殖池水质恶化，加速病原菌繁殖，引起疾病爆发。
因此，我们从凡纳滨对虾低温胁迫转录组中鉴定出一个显着差异表达的凡纳滨对虾胸腺素（Lvthy）基因，并通过RACE技术获得了该基因的全长。我们使用定量PCR 来分析该基因。分析其在各组织中的分布及低温胁迫下的表达。
最后，通过RANi干扰试验，研究了凡纳滨对虾Lvthy基因在低温胁迫下的功能，看看能否提高其存活率。
一、材料与方法
实验所需材料为（5.0180.380）g凡纳滨对虾，在人工海水中临时饲养2周后用于实验。
人工配制的海水盐度为30，pH值为8.2，温度为28。试验期间，每天9:00、17:00按时投喂饲料，总投喂量约为虾体质量的5%。 1小时左右采食基本完成后，应及时清理养殖水中残留的饵料和排泄物。
接下来，我们进行总RNA提取和cDNA合成。我们取凡纳滨对虾肌肉组织并快速保存在液氮中进行总RNA提取。
然后使用TRIZOL试剂提取总RNA。提取的总RNA用DNAaseI酶切后，使用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。
基于低温胁迫下的转录组数据，我们筛选了与斑节对虾胸腺肽基因同源的序列，然后设计了特异性引物来验证序列的准确性。
获得基因全长后，通过SMART预测其结构，然后根据获得的全长cDNA序列设计引物进行荧光定量PCR检测。
采用SYBRPremixExTaqKit(TaKaRa)进行荧光定量PCR检测。采用特异性引物QLv-thy-F/R检测Lvthy基因表达量。同时，根据现有研究中使用的引物Qbeta-actin-F/R确定内参基因。 -肌动蛋白的扩增。
凡纳滨对虾暂养2周后，随机选取3只凡纳滨对虾，取不同组织进行组织分布表达研究。
选择大脑、肝胰腺、眼柄、心脏、鳃、肌肉、胃、肠、睾丸、卵巢等组织，快速放入液氮中，提取总RNA，然后进行反转录，进行组织分布分析。
另外，将100尾凡纳滨对虾随机放入两个试验池中进行低温应激测试。应激组水温为13，对照组水温为28。其他水质参数保持不变。
低温刺激后0、1、3、6、12 h随机选取3条凡纳滨对虾，对其肌肉组织进行荧光定量PCR分析。
为了探讨Lvthy基因的表达与低温胁迫下凡纳滨对虾存活率的关系，我们对Lvthy基因进行了RNAi敲低实验。
首先，根据Lvthy基因的cDNA序列，设计特异性双链siRNA干扰链，针对三种不同的干扰靶点设计siRNA，选择干扰效果最好的siRNA进行Lvthy基因的干扰测试。
在进行干扰实验之前，我们首先测试了合成的siRNA的干扰效率。
虾暂时饲养后，按照1g/g的标准，将siRNA注射到第四腹节中。注射后12h和24h检测肌肉组织中Lvthy基因的表达量，计算干扰效率，选择最佳干扰效率。使用siRNA进行低温胁迫下的干扰实验，同时使用NC-siRNA作为对照。
低温干扰试验分为两组，一组为siRNA干扰组，另一组为NC-siRNA对照组。随机选取30头凡纳滨对虾进行干扰试验，按照1 g/g的标准进行Lvthy基因干扰试验。
按照上述方法暂时饲养凡纳滨对虾，然后注射siRNA。将注射siRNA的虾置于低温胁迫环境中，敲低Lvthy基因表达后24小时内观察虾的死亡率。
实验数据以平均值标准差表示。采用2-CT法计算基因的相对表达量。数据之间的显着差异通过单向方差分析进行处理。 P0.05被认为有显着性差异。使用Prism8 软件绘制处理后的数据。
经过上述实验，我们观察到以下情况。
二、Lvthy基因在不同组织的表达分析
Lvthy基因全长1765bp，开放阅读框长度729bp，5'非编码区（5'-UTR）和3'非编码区（3'-UTR）均为201bp分别为834bp和834bp，编码242个氨基酸。
然后我们对Lvthy基因编码的蛋白质进行了分析，结果显示预测的蛋白质分子量约为27.35ku。
SMART预测发现Lvthy含有6个胸腺素--肌动蛋白结合基序。
然后利用荧光定量PCR技术分析了Lvthy基因在凡纳滨对虾10个不同组织中的表达情况。
结果显示其在10种组织中表达。胃中表达量最高，其次是肠和心脏。表达水平最低的是肌肉，其次是睾丸和卵巢组织。
然后采用荧光定量PCR技术分析了低温胁迫下凡纳滨对虾肌肉中Lvthy基因的表达情况。
与对照组相比，急性低温胁迫下Lvthy基因表达量先升高后降低。低温胁迫3 h后表达量达到最高，是对照组的2.7倍，随后Lvthy表达量呈下降趋势。
三、Lvthy基因干扰试验
我们利用荧光定量PCR分析干扰Lvthy基因后肌肉组织中该基因的相对表达量。不同目标的干扰效果不同。
与对照组相比，注射siRNA1靶标后，12小时和24小时后的基因表达水平分别为对照组的35%和22%。
注射siRNA2和siRNA3干扰后，Lvthy基因的表达量分别为对照组的36%和49%、62%和98%。但NC-siRNA组Lvthy基因的表达量与空白对照组、DEPC处理水组无显着差异。改变。
针对Lvthy基因的3个干扰靶点设计的RNAi干扰链中，siRNA1的干扰效果最好，因此选择siRNA1干扰靶点进行后续实验。
干扰凡纳滨对虾Lvthy基因表达后，对虾进行低温胁迫，计算胁迫24小时内的存活率。
结果显示，干扰组24小时内存活率（31%）显着低于对照组（83%）。
四、凡纳滨对虾Lvthy序列分析
温度是影响凡纳滨对虾生长最直接的环境因素。温度的变化会引起凡纳滨对虾生存和生理环境的变化，严重时会导致机体死亡。
通过分析Lvthy基因序列，我们发现不同Lvthy基因中胸腺素--肌动蛋白结合基序的数量不同。
在无脊椎动物中，通常存在一个或多个胸腺肽基因，并且每个胸腺肽基因通常包含一个或多个胸腺肽--肌动蛋白结合基序。
目前克氏原螯虾中已鉴定出9种胸腺肽-基因；通讯小龙虾中已鉴定出5种胸腺肽基因；中华绒螯蟹中已发现2种胸腺肽基因，日本对虾中有4种胸腺肽基因。
此外，还发现同一物种的胸腺素中含有的胸腺素-肌动蛋白具有不同数量的结合基序，但它们在序列上高度保守，均属于胸腺素-基因家族。
通过对克隆的Lvthy基因的分析，我们发现Lvthy基因是一个由6个胸腺素-肌动蛋白结合基序组成的胸腺素-。
这种基序数量的差异可能伴随着不同的生物学功能。
五、凡纳滨对虾Lvthy表达谱分析
我们通过荧光定量PCR分析发现，温度胁迫会导致Lvthy基因表达上调。
在实际养殖生产过程中，当环境温度降低时，凡纳滨对虾的肌肉开始变白，游泳能力下降，活力下降。
胸腺素是一种天然存在的G-肌动蛋白隔离蛋白，在G-肌动蛋白丝聚合成F-肌动蛋白中发挥作用，对于维持细胞骨架甚至细胞存活至关重要。
在我们的实验中，低温应激可以诱导Lvthy基因表达增加，体内会产生大量胸腺素。
它能促进G-肌动蛋白聚集成F-肌动蛋白，从而促进虾在低温环境下的运动，维持正常的细胞骨架，增强其对低温环境的适应性，减少环境对凡纳滨对虾细胞的损害。
然后我们通过siRNA干扰实验发现，胸腺肽可以提高凡纳滨对虾在低温胁迫下的存活率。
通过干扰低温胁迫下的Lvthy基因，发现敲低Lvthy基因的表达后，凡纳滨对虾在低温环境下的存活率显着降低（P<0。05）。
低温应激会导致组织细胞发生凋亡，最终导致机体死亡，而胸腺素具有阻止组织凋亡的功能。
可以推测，凡纳滨对虾在低温环境下，会上调Lvthy基因的表达，产生大量的胸腺素来保护体细胞，减少低温下体细胞凋亡的发生。温度应激，从而保证机体细胞在低温下的生存。环境中的存活率。
干扰Lvthy基因的表达后，机体无法产生足够的胸腺素来维持细胞的正常生理状态，导致凡纳滨对虾死亡率很高。
结论
经过实验，我们发现凡纳滨对虾肌肉组织中Lvthy基因的表达量在低温胁迫3小时后显着增加。敲低Lvthy基因的表达后，凡纳滨对虾在低温胁迫下的存活率显着降低。
这表明Lvthy在凡纳滨对虾应对低温胁迫中发挥着重要作用。
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相关问答
答： 凡纳滨对虾是常见的养殖品种，它们对温度较为敏感。寒冷的冬季会降低它们的生存能力。不过，通过研究发现，在低温环境下，凡纳滨对虾可以通过上调 Lvthy 基因来提升其抗寒性，从而提高存活率。这种基因调节机制就像给虾子穿上了一件御寒衣裳，帮助它们更好地抵抗寒冷挑战。
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答： 目前，一些研究者正在探索利用这个 Lvthy 基因的特性来培育更耐寒的凡纳滨对虾品种。如果成功，将有助于提高养殖效率，减少低温天气造成的损失。同时，也会为生物技术提供新的思路，帮助解决气候变化带来的生存压力。
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答： Lvthy 基因是一种重要的调控基因，在动物体内能够调节一系列生理功能。在凡纳滨对虾中，Lvthy 基因主要参与到抗寒机制的控制之中。当环境温度下降时， Lvthy 基因会开始表达，促使虾体产生特定的蛋白和物质，帮助它们抵抗寒冷带来的伤害，例如减少细胞损伤、维持内部环境稳定等。
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答： 研究已经证明，在低温环境下，凡纳滨对虾中 Lvthy 基因的表达量显著增加。同时，Lvthy 基因的高表达也与虾子的抗寒能力增强有关。这些结果表明 Lvthy 基因对于凡纳滨对虾在低温环境下的生存至关重要。
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